Khái quát các phương pháp bảo quản Lactobacillus sp. trong các sản phẩm thương mại

Lactobacillus là chi lớn nhất trong nhóm vi khuẩn lactic (LAB). Nó phân bố đa dạng và chiếm phần lớn trong số vi khuẩn lactic đã được phân lập, có nguồn gốc chủ yếu từ hệ đường ruột người, động vật, thực vật, thực phẩm và ngay cả trong môi trường bùn, nước nuôi trồng thủy sản nhưng cũng cho thấy sự biến đổi lớn về kiểu hình, sinh hóa và sinh lý ở các chủng có nguồn gốc phân lập khác nhau. Lactobacillus sp. được xem là giống vi khuẩn thường dùng nhiều trong công nghệ lên men thực phẩm như là pho mát, sữa chua, bánh mì bột chua, ủ chua, ô liu, dưa cải bắp, cá lên men và xúc xích. Chúng có thể xem như chất bảo quản sinh học tự nhiên trong thực phẩm lên men và ức chế các vi khuẩn gây hại.

Lactobacillus sp. không chỉ có tác dụng bảo quản sản phẩm thực phẩm mà còn có tác dụng tốt cho sức khỏe của người và động vật, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng các chủng Lactobacillus có khả năng đi xuyên qua dạ dày đến khu trú vào hệ đường ruột người và động vật giúp tăng cường sức khỏe cho vật chủ (Slover and Danziger, 2008).

Cơ chế bảo vệ hệ đường ruột vật chủ của vi khuẩn lactic là do Lactobacillus có khả năng: kích thích sản xuất immunoglobulin, cảm ứng interferon, đại thực bào, axit hóa môi trường đường ruột, giảm cholesteron trong máu, sản xuất các hợp chất thứ cấp, sản xuất bacteriocin và khả năng chiếm chỗ trên màng mucus của ruột làm ức chế hay tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh làm hệ đường ruột khỏe mạnh hơn giúp tăng sức khỏe cho vật chủ. (Sanders, 1993; Schiffrin and Blum, 2001).

Do vai trò của Lactobacillus sp. ngày càng được khám phá nhiều hơn và ứng dụng rộng rãi hơn trong lĩnh vực chế thực phẩm, dược phẩm và thuốc thú y thủy sản nên nhu cầu về sản lượng tiêu thụ trên thế giới ngày càng tăng. Tuy nhiên, hiệu suất sản xuất và mật số sống sót của Lactobacillus sp. trong quá trình bảo quản thường không cao nên giá thành sản xuất cao và thời gian bảo quản ngắn. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng khả năng sống sót của Lactobacillus plantarum sau khi sấy là 0,85% (Lapsiri et al., 2012). Trong khi đó, tỷ lệ sống sót sau sấy của L.acidophilus là 2.5% (Behboudi-Jobbehdar et al., 2013). Với các tỷ lệ sống sót sau sấy thấp, thời gian bảo quản ngắn nên sẽ đẩy giá thành probiotics lên rất cao và vi khuẩn tổn thương nhiều nên thời gian bảo quản nếu kéo dài sẽ không đủ mật số để xác định hiệu quả của probiotics trên các đối tượng thử nghiệm.

Điều này, gây ảnh hưởng lớn tới khả năng sử dụng Lactobacillus một cách rộng rãi, nhất là cho nuôi trồng thủy sản (Walker et al., 1999). Do vậy, trong những năm gần đây, có rất nhiều nghiên cứu nhằm nâng cao khả năng sống sót của Lactobacillus sp. trong quá trình sản xuất và bảo quản chế phẩm Lactobacillus sp. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng việc sử dụng stress môi trường ngoài như nhiệt độ, pH, áp suất thẩm thấu, oxy, áp suất cao, và thiếu dinh dưỡng thì tế bào vi khuẩn sẽ phản ứng tạo các hợp chất bảo vệ, chính các hợp chất này sẽ giúp cho vi khuẩn tăng tỷ lệ sống sót trong quá trình sấy và bảo quản sinh khối. Bên cạnh đó, khi vi khuẩn được nuôi cấy trong điều kiện stress cũng ghi nhận được có sự thay đổi lớn về hệ thống proteomic (Rallu et al., 1996; Sanders et al., 1999; Van de Guchte et al., 2002; Champomier-Verges et al., 2002).

Stress nhiệt

Tăng hoặc giảm nhiệt độ môi trường nuôi dưới nhiệt độ gây chết vi khuẩn trong một thời gian nhất định trước khi cho tế bào vi khuẩn đó chịu đựng ngưỡng nhiệt độ gây chết sẽ làm tăng khả năng sống sót của vi khuẩn khi tế bào chịu đựng ở nhiệt độ gây chết. Giống Lactobacillus delbrueckii sub sp.Bulgaricus rất nhạy cảm với nhiệt độ, nếu đem tế bào vi khuẩn này ở exponential phase xử  lý ở nhiệt độ là 65⁰C trong 10 phút thì mật số vi khuẩn sau xử lý sẽ là 0.0001–0.015% (Gouesbet et al. 2001). Nhưng nếu thực hiện gây stress môi trường nuôi vi khuẩn này ở nhiệt độ là 50⁰C trong 30 phút trước khi cho chúng trải qua nhiệt độ gây chết (65⁰C trong 10 phút), tỷ lệ sống sót tăng từ 10-1000 lần tùy thuộc vào từng chủng. Nhiều nghiên cứu khác cũng chứng minh sự ảnh hưởng tích cực tới tỷ lệ sống sót của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus NCFM, Lactobacillus casei LC301, Lactobacillus helveticus LH212(Broadbent et al., 1997), Lactobacillus collinoides (Laplace et al., 1999), Lactobacillus paracasei NFBC 338 (Desmond, 2005) và Lactobacillus plantarum DPC2102 (Jordan and Cogan, 1999) khi cho tế bào trải qua quá trình xử lý nhiệt vừa phải trước khi cho chúng đối diện với ngưỡng nhiệt độ gây chết.

Tổng quát, có thể chia stress môi trường nuôi thành 2 nhóm:

Nhóm 1 là nhóm dùng các yếu tố vật lý, hóa học để stress vi khuẩn trong quá trình nuôi nhằm gia tăng khả năng chống chịu của vi khuẩn tới sự tác động của cùng yếu tố vật lý, hóa học đó nhưng với cường độ hoặc mức độ cao hơn từ đó có thể cải thiện khả năng sống sót của vi khuẩn trong quá trình sản xuất và bảo quản (Sanders et al., 1999).

Nhóm 2 là sử dụng một tác nhân bất lợi của môi trường giúp vi khuẩn đáp ứng với nhiều tác nhân khác (Hecker et al., 1996; Pichereau et al., 2000). Nếu tiền xử lý L.acidophilus bằng NaCl trong quá trình nuôi sinh khối sẽ giúp cho chúng tăng cường khả năng kháng muối mật và kháng nhiệt độ cao hơn nhóm đối chứng (Kim et al., 2001). Đối với vi khuẩn L. paracasei NFBC 338, nếu tiền xử lý chúng bằng dung dịch NaCl 0.3 M thì khả năng sống sót khi xử lý ở nhiệt độ (60⁰C trong 30 phút) là (33.5% so với0.1% ở nhóm đối chứng (Desmond et al., 2002; Desmond, 2005).  Nếu tăng nồng độ NaCl xử lý lên 0.4 M NaCl thì vẫn còn hiệu quả ở tất cả các vi khuẩn Lactobacillus sp., nhưng nếu thay NaCl bằng trehalose 0.66 M cũng dẫn tới sự tăng khả năng chịu nhiệt nhưng kết quả này tùy thuộc rất nhiều vào từng chủng vi khuẩn nhất định. Tuy nhiên, kết quả này lại không đúng nếu sử dụng sucrose ở nồng độ 0.48 M (Gouesbet et al., 2001). Theo Desmond et al. (2001), Desmond et al. (2002) và Desmond (2005) khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn probiotic L. paracasei NFBC 338 tăng lên khi tiền xử lý bằng NaCl trong khi tiền xử lý bằng muối mật hoặc H₂O₂ điều không làm tăng khả năng kháng nhiệt của vi khuẩn này. 

Tỷ lệ sống sót của vi khuẩn Lactobacillus sp. sau stress nhiệt nóng ở các ngưỡng khác nhau vượt trội so với không stress nhiệt khi đối mặt với các điều kiện gây chết. Tỷ lệ sống sót tăng từ 5 đến 700 lần so với đối chứng. Kết quả trình bày ở Bảng 1.

Bảng 1: Mức tăng tỷ lệ sống sót của vi khuẩn Lactobacillus sp. khi stress nhiệt nóng trước khi cho xử lý ở điều kiện gây chết

Huấn luyện thích nghi ở nhiệt độ thấp

Ngoài stress nhiệt nóng việc huấn luyện tính thích nghi với nhiệt độ thấp có tầm quan trọng lớn vì nhiều quá trình lên men với Lactobacillus sp. kết thúc thường được bảo quản bằng nhiệt độ thấp hoặc sấy đông khô. Nếu vi khuẩn thích nghi được điều đó khả năng sống sót sẽ tăng trong quá trình chế biến và bảo quản. Hơn nữa, khả năng tồn tại cao của Lactobacilli trong quá trình bảo quản nhiệt độ thấp của các sản phẩm lên men, của chế phẩm sinh học trước khi tiêu thụ là yếu tố quyết định đến tác dụng và hiệu quả của Lactobacillus sp.

Lactobacillus có thể thích nghi một cách tự nhiên với việc giảm nhiệt độ. Chúng tiếp tục phát triển nhưng với tốc độ sinh trưởng giảm sau khi nhiệt độ giảm khoảng 20⁰C dưới mức nhiệt độ tối ưu. Lactobacillus sanfranciscensis, L. plantarum, L. brevis, L. hilgardii, L. alimentarius và L. fructivorans phát triển tối ưu trong khoảng từ 30 hoặc 37⁰C. Chúng có thể tăng trưởng ở 15⁰C nhưng không dưới 7⁰C. Ở 15⁰C, L. sanfranciscensis CB1 có Lag phase trễ từ khoảng 2 đến 5 giờ và thấp nhấtkhoảng 10 giờ so với nhiệt độ nuôi tối ưu. Ngược lại, khi nhiệt độ làgiảm nhanh chóng từ 30 hoặc 37⁰ C xuống 15⁰C, sự tăng trưởng củacác tế bào giữa pha tăng trưởng có thể tạm thời dừng lại.

Nhưng nếu thực hiện stress thích nghi trong khoảng thời gian từ khoảng 30 đến 120 phút trước khi cho chúng tăng trưởng trở lại. Sau khi stress thích nghi, thời gian thế hệ cho L. sanfranciscensis CB1 là khoảng 3 giờ (De Angelis et al., 2004; De Angelis and Gobbetti, 2004).

Lạnh đông có thể gây ra các hư hại cho tế bào do sự hình thành các tinh thể băng mà còn bởi tính thẩm thấu do nồng độ cao của các chất hòa tan nội bào. Sự hư hỏng màng và sự biến tính của các đại phân tử là yếu tố xác định tỷ lệ sống sau khi đóng băng (Franks, 1995; Thammavongs et al., 1996). Tuy nhiên, các yếu tố khác như sự khác biệt về chủng và loài, điều kiện tăng trưởng, tuổi của vi khuẩn và bản chất của chất trợ đông cũng ảnh hưởng đến sự tồn tại của Lactobacilli sau khi quá trình lạnh đông (Champagne et al., 1991; Baati et al., 2000).

Sự sống sót sau khi lạnh đông L. plantarum DB200, L. brevis H12, L. plantarum 20Bvà L. sanfranciscensis CB1 được nuôi cấy ở 30⁰C tương ứng là 1,0; 0,25; 0,12 và0,04% (De Angelis and Gobbetti, 2004).

Khi các tế bào vi khuẩn được cho chịu lạnh ở 15⁰C trong 2 giờ trước khi lạnh đông, khả năng sống sót tăng khoảng 10 lần đối với L. sanfranciscensis CB1, gấp 25 lần đối với L. plantarum DB200 và L. brevis H12 và gấp 100 lần cho L. plantarum 20B (Bảng 2).

Bảng 2: Mức tăng tỷ lệ sống sót của vi khuẩn Lactobacillus sp. khi stress nhiệt nóng trước khi cho xử lý ở điều kiện gây chết.

Sống sót trong điều kiện môi trường có nồng độ acid cao đó là hiệu quả tích cực của quá trình thích ứng với môi trường có pH thấp của vi khuẩn. Quá trình thích ứng này được gọi là cơ chế đáp ứng nồng độ acid (ATR) (Foster and Hall, 1991). Các tế bào vi khuẩn được cho thích nghi với môi trường pH thấp (30 phút và pH 4,75). Vi khuẩn L. subbrueckii sub sp. Bulgaricus có khả năng tăng sức chịu đựng được khoảng 250 lần so với đối chứng khi chịu đựng ở ngưỡng nồng độ acid gây chết (30 phút ở pH 3,6) so với đối chứng.

Ủvi khuẩn L. collinoides ở pH 3.5 trong 30 phút kết quả có 0.015% số lượng tế bào còn sống sót. Tuy nhiên, khi cho tế bào làm quen với môi trường có pH = 5.0 trong 90 phút, khả năng sống sót của vi khuẩn tăng lên 1600 lần so với đối chứng. Mật số L. sanfranciscensis CB1 giảm nhanh chóng khi chuyển từ pH 6.4 xuống pH 3.2–3.4. Tuy nhiên, nếu vi khuẩn được stress kích thích ở pH 5.0 trong 1 giờ trước khi xử lý ở pH 3.2–3.4 trong 10 giờ khả năng sống sót tăng lên 46103 lần (De Angelis et al., 2001).

Lactobacillithường tiếp xúc với những thay đổi nồng độ chất tan trong môi trường sống tự nhiên của chúng. Tuy nhiên, nồng độ chất tan trong tế bào chất của chúng thì lại cần tương đối ổn định (Poolman and Glaasker, 1998). Sự gia tăng đột ngột nồng độ thẩm thấu của môi trường dẫn đến sự di chuyển của nước từ tế bào ra bên ngoài gây ra sự mất nước, thay đổi nồng độ chất tan nội bào và thay đổi tế bào âm lượng. Khi tế bào trải qua nồng độ muối NaCl 18% trong 2 giờ, sự sống sót của các tế bào vi khuẩn L. acidophilus giảm xuống 46%. Khi xử lý tế bào vi khuẩn 1 giờ ở nồng độ NaCl (2%) tăng độ sống sót và tăng sức đề kháng với muối mật (Lemay et al., 2000). Bổ sung NaCl với sự hiện diện của glycine, betaine cải thiện đáng kể sự sống sót của L. acidophilus, L. jonsonii và vi khuẩn Lactobacillus khác trong quá trình đông khô (Zink et al., 2000).

          Tài liệu tham khảo

Adhikari, K., A. Mustapha, I. U. Grun and L. Fernando (2000). “Viability of microencapsulated bifidobacteria in set yogurt during refrigerated storage.” J Dairy Sci 83(9): 1946-1951.

Baati, L., C. Fabre-Gea, D. Auriol and P. J. Blanc (2000). “Study of the cryotolerance of Lactobacillus acidophilus: effect of culture and freezing conditions on the viability and cellular protein levels.” Int J Food Microbiol 59(3): 241-247.

Behboudi-Jobbehdar, S., C. Soukoulis, L. Yonekura and I. Fisk (2013). “Optimization of Spray-Drying Process Conditions for the Production of Maximally Viable Microencapsulated L. acidophilus NCIMB 701748.” Drying Technology 31(11): 1274-1283.

Broadbent, J. R., C. J. Oberg, H. Wang and L. Wei (1997). “Attributes of the Heat Shock Response in Three Species of Dairy Lactobacillus.” Systematic and Applied Microbiology 20(1): 12-19.

Champagne, C. P., H. Detournay and M.-J. Hardy (1991). “Effect of medium on growth and subsequent survival, after freeze-drying, ofLactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus.” Journal of Industrial Microbiology 7(2): 147-149.

Champomier-Verges, M. C., E. Maguin, M. Y. Mistou, P. Anglade and J. F. Chich (2002). “Lactic acid bacteria and proteomics: current knowledge and perspectives.” J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 771(1-2): 329-342.

De Angelis, M., L. Bini, V. Pallini, P. S. Cocconcelli and M. Gobbetti (2001). “The acid-stress response in Lactobacillus sanfranciscensis CB1.” Microbiology 147(Pt 7): 1863-1873.

De Angelis, M., R. Di Cagno, C. Huet, C. Crecchio, P. F. Fox and M. Gobbetti (2004). “Heat shock response in Lactobacillus plantarum.” Applied and environmental microbiology 70(3): 1336-1346.

De Angelis, M. and M. Gobbetti (2004). “Environmental stress responses in Lactobacillus: A review.” PROTEOMICS 4(1): 106-122.

Desmond, C., R. P. Ross, E. O’Callaghan, G. Fitzgerald and C. Stanton (2002). “Improved survival of Lactobacillus paracasei NFBC 338 in spray-dried powders containing gum acacia.” Journal of Applied Microbiology 93(6): 1003-1011.

Desmond, C., C. Stanton, G. F. Fitzgerald, K. Collins and R. Paul Ross (2001). “Environmental adaptation of probiotic lactobacilli towards improvement of performance during spray drying.” International Dairy Journal 11(10): 801-808.

Desmond, C. B. (2005). “Development of dairy-based functional foods containing probiotics and prebiotics.” Aust. J. Dairy Technol. 60: 121-126.

Fabian, E. and I. Elmadfa (2006). “Influence of daily consumption of probiotic and conventional yoghurt on the plasma lipid profile in young healthy women.” Ann Nutr Metab 50(4): 387-393.

Foster, J. W. and H. K. Hall (1991). “Inducible pH homeostasis and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium.” J Bacteriol 173(16): 5129-5135.

Franks, F. (1995). Protein Destabilization at Low Temperatures. Advances in Protein Chemistry. C. B. Anfinsen, F. M. Richards, J. T. Edsall and D. S. Eisenberg, Academic Press. 46: 105-139.

Gouesbet, G., G. Jan and P. Boyaval (2001). “Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus thermotolerance.” Lait 81(1-2): 301-309.

Hecker, M., W. Schumann and U. Volker (1996). “Heat-shock and general stress response in Bacillus subtilis.” Mol Microbiol 19(3): 417-428.

Jordan, K. N. and T. M. Cogan (1999). “Heat resistance of Lactobacillus spp. isolated from Cheddar cheese.” Letters in Applied Microbiology 29(2): 136-140.

Kim, W. S., L. Perl, J. H. Park, J. E. Tandianus and N. W. Dunn (2001). “Assessment of stress response of the probiotic Lactobacillus acidophilus.” Curr Microbiol 43(5): 346-350.

Krasaekoopt, W., B. Bhandari and H. Deeth (2003). “Evaluation of encapsulation techniques of probiotics for yoghurt.” International Dairy Journal 13(1): 3-13.

Laplace, J. M., N. Sauvageot, A. Hartke and Y. Auffray (1999). “Characterization of Lactobacillus collinoides response to heat, acid and ethanol treatments.” Applied Microbiology and Biotechnology 51(5): 659-663.

Lapsiri, W., B. Bhandari and P. Wanchaitanawong (2012). “Viability of Lactobacillus plantarum TISTR 2075 in Different Protectants during Spray Drying and Storage.” Drying Technology 30(13): 1407-1412.

Lemay, M. J., N. Rodrigue, C. Gariepy and L. Saucier (2000). “Adaptation of Lactobacillus alimentarius to environmental stresses.” Int J Food Microbiol 55(1-3): 249-253.

  Nguyen HT, H Razafindralambo, A Richel, N Jacquet…(2015). Scalable temperature induced stress for the large-scale production of functionalized bifidobacteria – Journal of industrial microbiology & biotechnology

 Nguyen HT, DH Truong, S Kouhoundé, S Ly…(2016) Biochemical engineering approaches for increasing viability and functionality of probiotic bacteria – International journal of molecular sciences, 2016

Pichereau, V., A. Hartke and Y. Auffray (2000). “Starvation and osmotic stress induced multiresistances. Influence of extracellular compounds.” Int J Food Microbiol 55(1-3): 19-25.

Poolman, B. and E. Glaasker (1998). “Regulation of compatible solute accumulation in bacteria.” Mol Microbiol 29(2): 397-407.

Rallu, F., A. Gruss and E. Maguin (1996). “Lactococcus lactis and stress.” Antonie Van Leeuwenhoek 70(2-4): 243-251.

Sanders, J. W., G. Venema and J. Kok (1999). “Environmental stress responses in Lactococcus lactis.” FEMS Microbiology Reviews 23(4): 483-501.

Sanders, M. E. (1993). “Summary of conclusions from a consensus panel of experts on health attributes of lactic cultures: significance to fluid milk products containing cultures.” J Dairy Sci 76(7): 1819-1828.

Sankha Bhattacharya (November 5th 2018). Cryoprotectants and Their Usage in Cryopreservation Process, Cryopreservation Biotechnology in Biomedical and Biological Sciences, Yusuf Bozkurt

Schiffrin, E. J. and S. Blum (2001). “Food processing: probiotic microorganisms for beneficial foods.” Curr Opin Biotechnol 12(5): 499-502.

Slover, C. M. and L. Danziger (2008). “Lactobacillus: a Review.” Clinical Microbiology Newsletter 30(4): 23-27.

Thammavongs, B., D. Corroler, J. M. Panoff, Y. Auffray and P. Boutibonnes (1996). “Physiological response of Enterococcus faecalis JH2-2 to cold shock: growth at low temperatures and freezing/thawing challenge.” Lett Appl Microbiol 23(6): 398-402.

van de Guchte, M., P. Serror, C. Chervaux, T. Smokvina, S. D. Ehrlich and E. Maguin (2002). “Stress responses in lactic acid bacteria.” Antonie Van Leeuwenhoek 82(1-4): 187-216.

Walker, D. C., H. S. Girgis and T. R. Klaenhammer (1999). “The groESL chaperone operon of Lactobacillus johnsonii.” Appl Environ Microbiol 65(7): 3033-3041.

Zink, R., C. Walker, G. Schmidt, M. Elli, D. Pridmore and R. Reniero (2000). “Impact of multiple stress factors on the survival of dairy lactobacilli.” Sciences des Aliments 20(1): 119-126.

Nguyễn Thị Vân

Đăng ngày: 10/07/2020